Intropica
Efecto del formulado comercial de Trichoderma harzianum en semillas de trigo
Artículo de investigación científica y tecnológica

Efecto del formulado comercial de Trichoderma harzianum en semillas de trigo

Ingrid A. Morinigo-Villan+ , Gustavo D. Vega-Britez+ , Nelson D. Lesmo-Duarte+ , José A. Velázquez-Duarte+ , Karem H. Gennaro-Campos + , Jorge D. Alvarenga-Serafini+

Ingrid A. Morinigo-Villan
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Pedro Juan Caballero, Paraguay
https://orcid.org/0000-0001-7865-6892
Gustavo D. Vega-Britez
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Pedro Juan Caballero, Paraguay
https://orcid.org/0000-0002-4051-2110
Nelson D. Lesmo-Duarte
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Pedro Juan Caballero, Paraguay
https://orcid.org/0000-0002-3636-4290
José A. Velázquez-Duarte
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Pedro Juan Caballero, Paraguay
https://orcid.org/0000-0002-1172-0260
Karem H. Gennaro-Campos
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Pedro Juan Caballero, Paraguay
https://orcid.org/0000-0003-1299-3890
Jorge D. Alvarenga-Serafini
Universidad Nacional de Asunción, Facultad de Ciencias Agrarias, Asunción, Paraguay
https://orcid.org/0000-0001-9768-7176
DOI: 10.21676/23897864.3095

Resumen

El trigo es uno de los cereales de mayor importancia en el mundo para el consumo humano y las enfermedades fúngicas y su control representa un gran desafío. Buscando alternativas de control biológico, este experimento se realizó con el objetivo de evaluar los efectos de diferentes dosis del formulado comercial a base de Trichoderma harzianum Rifai (1969), sobre la calidad fisiológica y sanitaria de las semillas. Se utilizó dos métodos de siembra: en Blotter test y siembra en almácigo, empleándose un diseño completamente al azar, compuesto con cinco tratamientos y ocho repeticiones de 50 semillas, totalizando 400 semillas, con tres diferentes dosis del producto (100, 200, 300 mL/100 kg de semilla), más el testigo absoluto y el químico (Carbendazin + Thiram). Los resultados fueron sometidos al ANAVA y al test de Tukey al 5 % de error. Los géneros de hongos identificados en las semillas de trigo fueron Rhizopus spp. y Aspergillus flavus, en el testigo prevalecieron hongos del género Rhizopus spp., mientras las aplicaciones de diferentes dosis de T. harzianum permitieron la disminución de sus colonias. Según el nivel de control, fueron satisfactoria las tres dosis del formulado comercial utilizado, además de influenciar positivamente en el porcentaje de germinación de las semillas con relación al testigo y el mayor índice de velocidad de emergencia fue observado con la aplicación de T. harzianum a una dosis de 300 mL/100 kg de semilla. T. harzianum puede ser utilizado como bioestimulantes de las plantas con buena capacidad antagónica contra los fitopatógenos que desarrollan enfermedades en semillas de trigo.

Palabras clave

Triticum aestivum; agente biológico; bioestimulantes; fitopatógenos Triticum aestivum; biological agent, biostimulant; phytopathogens

Introducción

La producción de trigo (Triticum aestivum L.) se ha convertido en una de las producciones más importantes en el Paraguay, con una producción anual de 700,000 toneladas provenientes de 428,648 hectáreas. Aparte de cubrir la demanda interna, el excedente es exportado (Cámara Paraguaya de Exportadores y Comercializadores de Cereales y Oleaginosas, 2018). Sin embargo, muchos de estos cultivos son afectados por enfermedades fúngicas que les causan daño en todo el mundo, lo que representa una amenaza a la seguridad alimentaria mundial. No obstante, el tratamiento de estas enfermedades se realiza normalmente mediante la utilización de defensivos químicos, lo que puede generar un impacto negativo tanto a las personas como al medio ambiente (Adnan et al., 2019).

Debido a lo anterior, ha surgido una alternativa ecológica eficiente capaz de reemplazar el uso de productos sintéticos en el tratamiento de semillas, lo que ha llevado a los investigadores a centrarse en el control biológico de las enfermedades fúngicas a través de agentes de control biológico, como los hongos antagonistas. Estos incluyen varios géneros de hongos que controlan y erradican eficientemente las enfermedades fúngicas en las plantas, entre los cuales se destaca el género Trichoderma. Además, estos hongos desempeñan un papel regulador en diversas interacciones fisiológicas de las plantas (Bunbury-Blanchette y Walker, 2019). Esto los convierte en uno de los controladores biológicos más efectivos, por su capacidad de controlar los hongos fitopatógenos y por ser inocuos para los humanos, animales de producción, plantas de interés económico y el medio ambiente (López-Bucio et al., 2015). Trichoderma es uno de los géneros de hongos más importantes conocidos por su actividad antagónica contra patógenos causantes de enfermedades; además, podría ser desarrollado como un potente biofertilizante y su uso podría servir como estrategia segura para un ambiente más saludable (Adnan et al., 2019; Zhang et al., 2019).

Según Xue et al. (2017), el uso de Trichoderma es una alternativa a los tratamientos de semillas, disminuyendo el efecto perjudicial de las principales enfermedades fúngicas del trigo como las producidas por Fusarium spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., y Alteranria spp., entre otras que se asocian con la reducción del vigor de las semillas y el establecimiento deficiente del trigo, ya que son transmitidas por la semilla. El uso de Trichoderma permite mejorar la germinación del trigo hasta en presencia del herbicida 2,4-D (Bernat et al., 2018). En efecto, este género de hongos ascomicetos tiene potencial antagónico para control de hongos que afectan los granos de trigos, tales como Cochliobolus sativus, Alternaria alternata, Rhizopus spp., Aspergillus spp. y Fusarium graminearum (El- Gremi et al., 2017). Por tanto, su uso para control biológico en el tratamiento de semillas de trigo es una alternativa que debe ser explorada y validada en la región norte de Paraguay, considerando que no existe registro de uso en el país.  Por lo expuesto, este trabajo fue realizado con el objetivo de evaluar los efectos de diferentes dosis del formulado comercial a base de Trichoderma harzianum (Rifai, 1969), sobre la calidad fisiológica y sanitaria de la semilla de trigo.

Materiales y métodos

El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de la división de Fitopatología del Departamento de Protección Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción, ubicada en la ciudad de Pedro Juan Caballero, Paraguay, durante el período comprendido entre los meses de junio y noviembre del año 2018. La población de estudio fue de semillas de trigo (Triticum aestivum) variedad IPR85. El producto comercial Trichodermil de la Empresa Koppert con formulación de Trichoderma harzianum, cepa ESALQ-1306, es una suspensión concentrada (48 g/l), en tanto que el fungicida Carbendazim + Thiram es producido por la empresa Tecnomyl S.A y tiene como nombre comercial Tiracarb, con formulación de Carbendazim metil benzimidazol-2-bcarbamato 15 %, Thiram bisulfuro de tetrametil tiocarbamato 35 % e inertes 50 %.

El experimento se realizó en dos ambientes: 1) en laboratorio donde las semillas fueron sembradas en el método de cámara húmeda (Blotter test) y 2) en almácigo donde las semillas fueron sembradas en tierra. El diseño experimental utilizado fue completamente al azar y comprendió cinco tratamientos y diez repeticiones. En cada repetición se utilizó una placa de Petri de 9 cm de diámetro conteniendo 40 semillas de trigo (Blotter test). Para la siembra en almácigo se preparó 1 m2 de suelo, en el cuál para cada tratamiento se implementaron ocho repeticiones de 50 semillas, totalizando 400 semillas por cada tratamiento, según indicaciones de las reglas del International Rules for Seed Testing (ISTA, 2012), con algunas adaptaciones.

Las semillas fueron tratadas con tres diferentes dosis del formulado comercial del aislado T. harzianum más  el testigo absoluto  para el test  de sanidad. El producto   utilizado en calidad de testigo químico fue el  Carbendazim + Thiram. Cada unidad experimental estuvo representada por una placa de Petri. Se utilizaron tres dosis de T. harzianum: la recomendada por el fabricante (200 ml), una de 50 % menos (100 ml) y otra de 50 % más (300 ml) (tabla 1).

Tratamiento Producto % Dosis (ml/100 kg de semilla)
T1 Agua destilada (Testigo) 0 0
T2 Carbendazin + Thiram (Químico) 100 250
T3 T. harzianum   50 100
T4 T. harzianum 100 200
T5 T. harzianum 150 300
Tabla 1. Descripción de los tratamientos en términos del porcentaje y las dosis de los productos empleados en el estudio comparativo ( Pedro Juan Cabal lero, Paraguay, 2018).

Para la preparación del caldo correspondiente a cada tratamiento se utilizó un vaso de precipitado, donde se vertieron 20 ml de agua destilada; seguidamente se diluyó en ella cada producto, con sus respectivas dosis para cada tratamiento. Las semillas de trigo fueron colocadas en una bolsa plástica transparente; posteriormente con ayuda de una jeringa se depositó la suspensión en el fondo de la bolsa plástica, agitándola manualmente por cerca de 5 minutos, proporcionando así una cobertura total a las semillas, las cuales fueron enseguida secadas sobre papel absorbente a temperatura ambiente (Colmán, 2011).

Posteriormente, se realizó la siembra con ayuda de una pinza esterilizada, distribuyendo 40 semillas de manera equidistante en cada placa de Petri (previamente esterilizadas en estufa a 150 °C por 4 horas). En cada placa se colocaron tres discos de papel absorbente y se vertieron 5 ml de agua destilada esterilizada, usando pipeta graduada, en condiciones de laboratorio (Neegaard, 1979). Todas las placas de Petri fueron mantenidas a temperatura ambiente durante ocho días, para promover la esporulación de los hongos.

La siembra en el almacigo se realizó con el propósito de evaluar el índice de velocidad de emergencia (ÍVE). Se utilizaron 1000 g de semillas de trigo, empleándose ocho repeticiones de 50 semillas para cada tratamiento (ISTA, 2012). La siembre se realizó manualmente, en surcos corridos a una profundidad de 2 cm, con una distancia de 2 cm entre semillas y 12 cm entre hileras, en suelo previamente humedecido. Las semillas fueron observadas con el microscopio estereoscopio para identificar las colonias de hongos; en el caso de aquellas colonias que no se pudieron identificar por este método, se rasparon las semillas con ayuda de un bisturí y la muestra fue colocada sobre el porta objeto y observada al microscopio óptico para identificar las estructuras de los hongos con la ayuda de claves de identificación (Menezes y Oliveira, 1993; Barnett y Hunter, 1998).

A los ocho días después de la siembra se determinó el porcentaje de semillas infestadas por hongos, cuantificando el número de semillas con colonias de hongos en cada placa de Petri, para cada una de las repeticiones de los diferentes tratamientos. Para ello se utilizó la siguiente formula (French y Hebert, 1980): Incidencia (%) = (número de semillas infectadas) / (número total de semillas) x 100. El nivel de control de los productos en estudio se estableció  conforme  a la metodología  descrita por Gennaro (2016), con algunas modificaciones (tabla 2).

Nivel de control de productos Símbolo Escala (% de control)
Excelente E 100
Muy Bueno MB 99 a 89
Bueno B 88 a 73
Bajo o Regular R 72 a 58
Muy Bajo o No Satisfactorio NS 57 a 28
No Efectivo o Ineficaz NE <27
Tabla 2. Escala del nivel de control de los productos utilizados (Pedro Juan Caballero - Paraguay, 2018).

El porcentaje de germinación fue determinado a los ocho días después de la siembra, cuantificando en cada placa de Petri las semillas que presentaron emisión de la radícula, considerando a éstas como semillas germinadas, utilizando la siguiente fórmula:

Germinación (%)= (semillas germinadas) / (número total de semillas) x 100

El IVE de las plántulas fue evaluado diariamente, desde el principio (cuarto día) hasta los ocho días después de la siembra, de acuerdo a Maguire, (1962):

IVE= (E1 / N1) + (E2 / N2) + …+ (En / Nn)

Donde:

IVE= Índice de velocidad de emergencia (plántulas/día)

Nn: Número de días a partir de la siembra, desde el primer hasta el último recuento (n).

En: Número de plántulas emergidas desde el primer hasta el último recuento (n).

Los resultados obtenidos fueron sometidos a análisis de varianza (ANAVA). En caso de significación estadística, las medias de los diferentes tratamientos fueron comparadas entre sí mediante el Test de Tukey (α=0,05).

Resultados

Hongos de los géneros Rhizopus spp. y Aspergillus flavus fueron identificados en el experimento (figura 1).

Figura 1. Hongos observados mediante el microscopio óptico, (1a) Rhizopus spp. y su colonia (1b); Aspergillus flavus (1c) y su colonia (1d).

Se observó un efecto de los tratamientos (p < 0,05) sobre la incidencia de hongos en semillas de trigo tratadas con diferentes dosis del T. harzianum (figura 2), en donde el testigo absoluto fue el tratamiento con mayor porcentaje de incidencia, con 72,8 % de hongos en sus semillas. La dosis recomendada por el fabricante (200 ml) fue la que determinó el menor porcentaje de incidencia de hongos (35,8 %). El porcentaje de germinación también fue influenciado por los tratamientos evaluados (p < 0,05), correspondiendo a la muestra testigo el menor porcentaje de germinación (30,5 %), en tanto que la dosis de 100 ml del formulado comercial T. harzianum produjo un 47,2 % de germinación. El mayor índice de velocidad de emergencia (IVE) se presentó con la dosis de 300 ml del formulado comercial de T. harzianum (13,1), y el menor (7,8) se obtuvo con el tratamiento químico y con la dosis de 100 ml del formulado comercial (figura 2).

Figura 2. Efecto de los diferentes tratamientos en la incidencia de hongos, germinación e IVE de las semillas de trigo (Pedro Juan Caballero – Paraguay, 2018). Letras diferentes en las barras indican diferencias estadísticamente significativas entre sí, según el test de Tukey (p<0,05) (IH= incidencia de hongos: 35,05; G= germinación: 14,34; IVE= índice de velocidad de emergencia: 4,09).

En todos los tratamientos las semillas tuvieron un porcentaje de germinación por debajo del 50 %, probablemente debido al tiempo de almacenamiento previo, que fue de seis meses a temperatura ambiente.

Con la dosis de 100 ml de T. harzianum se obtuvo el mayor porcentaje de germinación. Este resultado obtenido permite validar las recomendaciones del fabricante y garantizar su utilización por parte de los productores.

En la figura 3 se puede observar el porcentaje de colonias de cada género de hongo en las semillas de trigo. El testigo absoluto presentó la mayor cantidad de colonias de hongos contaminantes. Los géneros presentes en las semillas que no recibieron ningún tratamiento fueron Rhizopus spp. (64,3 %) y A. flavus (8,5 %). La dosis de 200 ml de T. harzianum presentó un 19,5 % de colonias de Rhizopus spp. y 16,3 % de A. flavus, en tanto que el tratamiento con Carbendazin + Thiram no presentó incidencia de A. flavus; solamente se pudieron identificar hongos del género Rhizopus (41,3 %). Dosis de 200 ml de T. harzianum presentaron menor incidencia de hongos, aunque son incapaces de neutralizar por completo la actividad de los hongos en las semillas.

El tratamiento químico produjo un control del 99,7 % de A. flavus y 59,0 % de Rhizopus spp. (tabla 3). En lo que respecta a T. harzianum, no hubo diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de control producido por las tres dosis de utilizadas. Caso contrario se evidenció en el caso de Rhizopus spp., mientras que en el caso de A. flavus el tratamiento químico produjo el mejor porcentaje de control, seguido por la dosis de 200 ml de T. harzianum.

Figura 3. Efecto de los diferentes tratamientos en las colonias de hongos de las semillas de trigo (Pedro Juan Caballero – Paraguay, 2018).

Según la escala presentada en la tabla 3, las dosis de 100, 200 y 300 ml de T. harzianum obtuvieron un nivel de control bueno de Rhizopus spp., en contraste con el tratamiento químico (Carbendazin + Thira), que presentó un nivel de control regular o muy bajo de estas colonias de hongos. El tratamiento químico presentó un nivel de control de A. flavus categorizado como muy bueno a excelente, en tanto que las dosis de T. harzianum presentaron un nivel de control de Aspergillus categorizado como bueno a regular (tabla 3)

Discusión

En los cincos tratamientos empleados en la investigación solamente fueron identificados dos taxones de hongos en las semillas de trigo: Rhizopus spp. y A. flavus. Estos taxones se encuentran entre los principales hongos transmitidos por semilla en las plantas de trigo (Pathak y Zaidi, 2013). Algunas investigaciones han demostrado bajo nivel antagonista de los microrganismos fúngicos utilizados para el control biológico de las enfermedades que afectan semillas de cereales (Zaidi et al., 2017). Sin embargo, entre las diferentes dosis utilizadas en el presente trabajo, la aplicación de 200 ml de T. harzianum presentó menor incidencia de hongos en comparación con el tratamiento químico, aunque este último controló de una forma más eficiente a Rhizopus spp. y a A. flavus, en comparación con las diferentes dosis de T. harzianum, resultados que son similares a los obtenidos por Pathak y Zaidi (2013) y Moya-Elizondo y Jacobsen (2016), donde la competencia puede ser el principal mecanismo de la actividad antagónica de T. harzianum (Kim y Knuden, 2013).

Aunque no demostraron un efecto total sobre los parámetros medidos, estos resultados sugieren que se puede utilizar el formulado comercial de T. harzianum como agente antagonista de control de hongos que provocan daños a las semillas de trigo. No obstante, una sola evaluación podría no ser suficiente para dilucidar la eficacia de los tratamientos utilizados; además, según Locatelli et al. (2017), el principal problema es la falta de formulaciones adecuadas, que garanticen la viabilidad y la eficiencia del agente de control biológico para su aplicación en el campo, lo que dificulta la expansión y el uso de bioplaguicidas en la agricultura convencional. Xue et al. (2017) sugieren que ensayos de campo en múltiples ubicaciones y años son necesarios para determinar la eficacia del tratamiento de semillas con un agente de control biológico. Estos autores no verificaron un efecto significativo del tratamiento de semilla de trigo al utilizar seis cepas de Trichoderma spp.; sin embargo, los resultados promedio de los tres años evaluados evidenciaron que las seis cepas redujeron significativamente la gravedad de la pudrición de raíz en más de un 50 % y aumentaron el rendimiento de los granos en 6 y 11%. Además, sugieren que es probable aumentar la eficacia de T. harzianum mediante combinación a una tasa reducida con un fungicida químico.

El comportamiento de Trichoderma spp. es similar al de un patógeno de planta que invade las estructuras de la raíz. Sin embargo, eventos subsiguientes como estallidos oxidativos, la síntesis de ácido salicílico por parte de las plantas y la secreción de proteínas de tipo inductor por Trichoderma spp. diferencia este hongo de los patógenos. Estos procesos inducen inmunidad en las plantas que ayudan a contrarrestar la invasión subsiguiente de patógenos e insectos (Mendoza-Mendoza et al., 2018). 

El mayor porcentaje de germinación de semillas de trigo tratadas con T. harzianum sugiere que este tratamiento podría haber actuado como promotor de crecimiento de las plantas y/o biofertilizante (Swain et al., 2018), además de su efecto antagonista contra los hongos que causan enfermedades en las semillas. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en algunos estudios anteriores (Mastouri et al., 2010; Wiśniewska et al., 2011; Xue et al., 2017; Zhang et al., 2019), los cuales calificaron a T. harzianum como un potencial promotor de crecimiento.

En trigo, T. harzianum demostró ser eficiente en el incremento del vigor de la raíz en condiciones de estrés hídrico (Shukla et al., 2014), recomendable para control de la roya en trigo, mejorando los parámetros de crecimiento y rendimiento del cultivo (El-Sharkawy et al., 2018) y promoviendo la ramificación de las raíces y la capacidad de absorción de nutrientes (Li et al., 2015), lo que aumenta el crecimiento, rendimiento de las plantas (López-Bucio et al., 2015).  Además, mejora la calidad y el rendimiento de la uva (Pascale et al., 2017) y proporciona tolerancia a plantas de tomate bajo estrés biótico y abiótico al elevar la concentración de prolina en la planta (Ghorbanpour et al., 2018).

La combinación de T. harzianum con la fertilización química con nitrógeno (N) permite una mayor eficiencia agronómica y de uso fisiológico en trigo (Meena et al., 2016) y es una de las soluciones sostenibles para mejorar la capacidad de bio-incrustración de las semillas, permitiéndoles establecerse y funcionar de manera consistente en el campo para la producción sostenible de los cultivos (Meena et al., 2017).

Por los hallazgos en la literatura, es posible afirmar que el uso de T. harzianum en tratamientos de semillas de trigo aún carece de eficacia máxima; sin embargo, favorece o estimula el crecimiento de las plantas (raíz, materia verde y la seca, peso e incluso el rendimiento de los granos) bajo estrés biótico y abiótico, actuando como bioestimulante y biofertilizante. Para estudios posteriores, su incorporación con insecticidas químicas puede ser oportuna como estrategia para disminuir el uso de las plaguicidas en cultivos agrícolas extensivos, como es el caso del trigo.

Conclusiones

Rhizopus spp. y Aspergillus flavus fueron los taxones de hongos encontrados en las semillas tratadas de trigo. El uso de T. harzianum a una dosis de 200 ml/100 kg de semilla disminuye la incidencia de hongos fitopatógenos y aumenta el control los mismos en la semilla de trigo.

La germinación y el índice de velocidad de emergencia de la semilla de trigo son influenciados positivamente por T. harzianum, en tanto que el control químico es más eficiente para el control de Aspergillus flavus.

El uso de T. harzianum influencia positivamente la calidad fisiológica y sanitaria de la semilla, aumentando la germinación y disminuyendo la incidencia de hongos fitopatogénos en las semillas.

Citas

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Cómo citar

Morinigo-Villan, I. A. ., Vega-Britez, G. D. ., Lesmo-Duarte, N. D. ., Velázquez-Duarte, J. A. ., Gennaro-Campos , K. H. ., & Alvarenga-Serafini, J. D. . (2019). Efecto del formulado comercial de Trichoderma harzianum en semillas de trigo. Intropica, 14(2), 104–111. https://doi.org/10.21676/23897864.3095